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原核表達(dá)載體現(xiàn)貨供應(yīng)

簡要描述:啟動子是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結(jié)合并起始RNA合成的序列,它是基因表達(dá)*的重要調(diào)控序列。沒有啟動子,基因就不能轉(zhuǎn)錄。由于細(xì)菌RNA聚合酶不能識別真核基因的啟動子,因此原核表達(dá)載體所用的啟動子必須是原核啟動子。

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  • 更新時(shí)間:2025-12-31
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詳細(xì)介紹

  原核表達(dá)載體指:能攜帶插入的外源核酸序列進(jìn)入原核細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制的載體。

 
  

 

 

編輯本段原核表達(dá)載體調(diào)控原件

1.啟動子

  啟動子是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結(jié)合并起始RNA合成的序列,它是基因表達(dá)*的重要調(diào)控序列。沒有啟動子,基因就不能轉(zhuǎn)錄。由于細(xì)菌RNA聚合酶不能識別真核基因的啟動子,因此原核表達(dá)載體所用的啟動子必須是原核啟動子。 原核啟動子是由兩段彼此分開且又高度保守的核苷酸序列組成,對mRNA的合成極為重要。在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游5~10 bp處,有一段由6~8個堿基組成,富含A和T的區(qū)域,稱為Pribnow 盒,又名TATA 盒或-10區(qū)。來源不同的啟動子,Pribnow 盒的堿基順序稍有變化。在距轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游35 bp處,有一段由10 bp組成的區(qū)域,稱為-35區(qū)。轉(zhuǎn)錄時(shí)大腸桿菌RNA聚合酶識別并結(jié)合啟動子。-35區(qū)與RNA聚合酶s亞基結(jié)合,-10區(qū)與RNA聚合酶的核心酶結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近DNA被解旋形成單鏈,RNA聚合酶使*和第二核苷酸形成磷酸二酯鍵,以后在RNA聚合酶作用下向前推進(jìn),形成新生的RNA鏈。 原核表達(dá)系統(tǒng)中通常使用的可調(diào)控的啟動子有Lac(乳糖啟動子)、Trp(色氨酸啟動子)、Tac(乳糖和色氨酸的雜合啟動子) 、lPL (l噬菌體的左向啟動子)、T7噬菌體啟動子等。

2. SD序列

  1974年Shine和Dalgarno首先發(fā)現(xiàn),在mRNA上有核糖體的結(jié)合位點(diǎn),它們是起始密碼子AUG和一段位于AUG上游3~10 bp處的由3~9 bp組成的序列。這段序列富含嘌呤核苷酸,剛好與16S rRNA 3¢末端的富含嘧啶的序列互補(bǔ),是核糖體RNA的識別與結(jié)合位點(diǎn)。以后將此序列命名為Shine-Dalgarno序列,簡稱SD序列。它與起始密碼子AUG之間的距離是影響mRNA轉(zhuǎn)錄、翻譯成蛋白的重要因素之一,某些蛋白質(zhì)與SD序列結(jié)合也會影響mRNA與核糖體的結(jié)合,從而影響蛋白質(zhì)的翻譯。另外,真核基因的第二個密碼子必須緊接在ATG之后,才能產(chǎn)生一個完整的蛋白質(zhì)。

3.終止子

  在一個基因的3¢末端或是一個操縱子的3'末端往往有特定的核苷酸序列,且具有終止轉(zhuǎn)錄功能,這一序列稱之為轉(zhuǎn)錄終止子,簡稱終止子(terminator)。轉(zhuǎn)錄終止過程包括:RNA聚合酶停在DNA模板上不再前進(jìn),RNA的延伸也停止在終止信號上,完成轉(zhuǎn)錄的RNA從RNA聚合酶上釋放出來。對RNA聚合酶起強(qiáng)終止作用的終止子在結(jié)構(gòu)上有一些共同的特點(diǎn),即有一段富含A/T的區(qū)域和一段富含G/C的區(qū)域,G/C富含區(qū)域又具有回文對稱結(jié)構(gòu)。這段終止子轉(zhuǎn)錄后形成的RNA具有莖環(huán)結(jié)構(gòu),并且有與A/T富含區(qū)對應(yīng)的一串U。轉(zhuǎn)錄終止的機(jī)制較為復(fù)雜,并且結(jié)論尚不統(tǒng)一。但在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí),為了穩(wěn)定載體系統(tǒng),防止克隆的外源基因表達(dá)干擾載體的穩(wěn)定性,一般都在多克隆位點(diǎn)的下游插入一段很強(qiáng)的rrB核糖體RNA的轉(zhuǎn)錄終止子。

 

編輯本段原核表達(dá)載體構(gòu)建

1.獲得目的基因

  (1)通過PCR方法:以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板,按基因序列設(shè)計(jì)一對引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點(diǎn)),PCR循環(huán)獲得所需基因片段。

 

  (2)通過RT-PCR方法:提取總RNA,以mRNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA*鏈,以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。

2.構(gòu)建重組表達(dá)載體

  (1)載體酶切:將表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶(同引物的酶切位點(diǎn))進(jìn)行雙酶切,酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后,用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。

 

  (2)PCR產(chǎn)物雙酶切后回收,在T4DNA連接酶作用下連接入載體。

3. 獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種

  (1) 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,根據(jù)重組載體的標(biāo)志(抗Amp或藍(lán)白斑)作篩選,挑取單斑,堿裂解法小量抽提質(zhì)粒,雙酶切初步鑒定。

 

  (2)測序驗(yàn)證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進(jìn)入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆,重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點(diǎn)。

 

  (3) 以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞。

  

 

 
 

1. pET系列載體
1. pET系列載體
78-pet-5a pET-5a 2ug
78-pet11a pET11a 2ug
78-pet-11b pET-11b 2ug
78-pet-11c pET-11c 2ug
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2. PTYB 系列載體 2. PTYB 系列載體
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4. pBAD系列載體 4. pBAD系列載體
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5.原核融合表達(dá)載體 5.原核融合表達(dá)載體
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6. 其他載體
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