疫苗DNA殘留對人體的潛在危害

對所使用的疫苗，我們zui關心的是疫苗的效果和其安全性。現在很多疫苗是細胞培養疫苗，比如重組（CHO細胞）乙肝疫苗，Vero細胞狂犬病疫苗等大多數疫苗都是用細胞培養的方法生產，而對疫苗的純化是關鍵問題，我們要盡可能的去除宿主細胞DNA和宿主蛋白。假若宿主細胞的DNA和蛋白同疫苗一起注入人體將會產生不可預料的后果。就以疫苗DNA殘留為例，疫苗DNA殘留可能造成插入突變﹑導致抑癌基因失活﹑癌基因被激活等，zui終造成疫苗使用者致癌。

疫苗DNA殘留的相關法規

由于有如此潛在的危險性，所以許多機構對疫苗DNA殘留制定了相關標準，1986年世界衛生組織規定用細胞系生產的疫苗DNA殘留不能超過100 pg /支 ，而在1998年世界衛生組織認為細胞系生產的疫苗DNA殘留不能超過10 ng /支，而在1997年美國藥品食品衛生監督局規定在美國使用的細胞系疫苗DNA殘留不能超過10 pg /支，中國規定的細胞系疫苗DNA殘留不能超過100 pg /支。

所以在疫苗生產中要隨時對DNA殘留進行檢測，以便知道每個過程除掉DNA殘留的能力。在每一批產品中我們必須檢測DNA殘留，所以我們必須運用敏感且行之有效的對DNA殘留定量的檢測方法。通常規定每支疫苗DNA殘留不能超過100 pg，也就大約等同于17個甚至更少CHO細胞基因組DNA的含量，對如此微量的DNA殘留進行檢測，所用的技術方法就必須相當敏感和穩定，現在對DNA殘留定量的方法主要有以下三種：
1、分子雜交技術檢測DNA殘留
2、基于DNA結合蛋白的方法（Threshold® immunoassay）檢測DNA殘留
3、實時定量PCR法檢測DNA殘留

分子雜交技術檢測DNA殘留的原理和方法

分子雜交分析的基本原理是基于DNA探針檢測變性而且固定在硝-酸纖維素膜上的宿主細胞DNA。這些探針可以不依賴宿主細胞DNA來制備，例如用隨機引物制備探針。探針上標記酶﹑生物素﹑放射性同位素﹑地高辛（Dig）等。由于地高辛標記核酸探針，操作方便、靈敏度高，已標記的探針在4℃貯存可達兩年之久，方便隨時應用，所以現在常采用地高辛標記核酸探針，用光標記法將光敏Dig標記到探針上，制成光敏-Dig-核酸探針，再與固定在硝--酸膜上的靶核酸進行靶DNA分子雜交，使之與抗Dig-堿性磷酸酶結合，zui后可用不同的檢測方式進行檢測，發光檢測和顯色檢測均可，靈敏度可達10pg以下（表 1  三種DNA殘留檢測方法的比較）。

基于DNA結合蛋白的方法（Threshold® Immunoassay）檢測DNA殘留的原理和方法

Threshold® Immunoassay分析系統是基于兩種DNA序列非特異性蛋白，單鏈DNA（ssDNA）結合蛋白（SSB）和抗ssDNA 的單抗。檢測的基本過程是當生物素—DNA單鏈結合蛋白和尿素酶—抗ssDNA 的單抗與變性的宿主細胞DNA結合zui終形成復合物，通過親合素將此復合物連接到生物素—硝--酸纖維素膜，在通過洗滌所有非特異性的被洗脫掉，zui后放于有尿素溶液的讀數儀，尿素酶催化尿素分解成NH3和CO2 導致PH值發生變化，讀數儀根據PH值的變化換算成DNA的量，從而達到檢測DNA殘留含量的目的。

實時定量PCR法檢測DNA殘留的原理和方法

熒光定量PCR是基于PCR擴增時，在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，產物的增加可以通過熒光信號指示，通過實時監控PCR體系中的熒光信號，對樣本中初始模板進行定量分析。定量PCR可實時檢測產物量，通過加入已知濃度的標準樣品繪制標準曲線，然后根據待測樣品在標準曲線中的位置推算初始模板的濃度，從而達到檢測DNA殘留含量的目的。

三種檢測DNA殘留方法的比較

3種方法用來檢測疫苗DNA殘留都要對樣品進行相應的處理，這對zui終的結果的準確性至關重要。而雜交相對對樣品DNA的損失小，而用Q-PCR需要提取樣品的DNA，損失較大。在我們選擇那種方法時我們要考慮它的穩定性，敏感性，成本等以至找到*的性價比的方法（表 1），從表1 我們不難發現使用分子雜交的方法是一種比較可行經濟實用的方法，目前國內也主要是用此方法。

表 1  三種DNA殘留檢測方法的比較

羅氏Roche DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II試劑盒產品簡介

產品中文名稱：高效DNA地高辛標記和檢測試劑盒II

羅氏應用科學部（Roche Applied Science）是zui早致力于向用戶提供非放射標記技術的公司之一，讓更多的科研工作者們可以避免使用危險的放射性同位素。DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II（第二代）是由羅氏公司研發，并且是在DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I（*代）的基礎上優化升級的，具有更高的準確性、更好的靈敏度、操作時間更短等特點。自1995年地高辛產品上市以來，盡管有定量PCR技術的應用，DIG系統仍然是非放射性高效標記—檢測技術的*，被廣泛地應用各種膜雜交及原位雜交技術中。

高效DNA地高辛標記和檢測試劑盒II 圖片

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羅氏Roche DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II檢測原理

該產品是用地高辛（地高辛：英文名Digoxigenin，簡稱DIG；又稱異羥基洋地黃毒甙元，是一種類固醇半抗原分子）標記的DNA探針，應用于分子雜交和隨后的化學發光檢測。檢測主要分三階段進行：1. DNA標記：根據隨機引物標記技術，生成DIG地高辛標記的DNA探針。 2. 雜交：按照標準雜交方法進行，將地高辛標記的DNA探針用于核酸點雜交，可選擇帶正電的尼龍膜或純硝--酸纖維素膜作為雜交膜。 3. 免疫學檢測：首先將標記有AP的地高辛抗體與雜交探針免疫結合；然后在477 nm波長下，通過檢測堿性磷酸酶與CSPD底物產生的化學發光反應的數值，從而達到免疫檢測的目的。

羅氏Roche DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II的顯著特點

★ Accurate and fast-----使用預混合的高效地高辛（DIG）標記的隨機引物可以縮短標記DNA探針的操作時間，提高標記物的產量。
★ Sensitive-----在人類DNA的復合物和植物基因組中，可以檢測到單個拷貝的基因。
★ Time-saving-----地高辛（DIG）標記的探針可以儲存一年以上，雜交液可以反復使用3～5次（具體要根據每次雜交過程中標記探針產生信號的強弱來確定）。

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