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Nippon Genetics Bambanker Direct 無血清無需離心細(xì)胞凍存液

更新時(shí)間:2024-01-30      點(diǎn)擊次數(shù):1711







Nippon Genetics Bambanker Direct 無血清無需離心細(xì)胞凍存液


冷凍保存哺乳動(dòng)物細(xì)胞在生物學(xué)研究中非常有價(jià)值和普遍。為了防止技術(shù)原因(培養(yǎng)操作)使細(xì)胞污染或物理原因(培養(yǎng)箱故障)使長(zhǎng)期培養(yǎng)功虧一簣。此外,長(zhǎng)期多次的培養(yǎng)和傳代,導(dǎo)致細(xì)胞在遺傳學(xué)性狀上的老化和分化都是促使在接收或生成新細(xì)胞系后首要考慮的最佳策略就是凍存細(xì)胞。低溫凍存對(duì)于維持一些特殊細(xì)胞株的遺傳特性極為重要。細(xì)胞深低溫保存的基本原理是:在-70℃以下時(shí),細(xì)胞內(nèi)的酶活性均己停止,即代謝處于停止?fàn)顟B(tài),故可以長(zhǎng)期保存。細(xì)胞低溫保存的關(guān)鍵,在于通過0℃到-20℃階段的處理過程。在此溫度范圍內(nèi),冰晶呈針狀,極易招致細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。

如何減少或者避免冰晶形成,如同凍存細(xì)菌時(shí)用的甘油,DMSO(二甲基亞砜)是一種滲透性保護(hù)劑,能夠降低細(xì)胞冰點(diǎn),減少冰晶的形成,減輕自由基對(duì)細(xì)胞損害,改變生物膜對(duì)電解質(zhì)、藥物、毒物和代謝產(chǎn)物的通透性。凍存液中加入后可以使溶液冰點(diǎn)降低,加之在緩慢凍結(jié)條件下,細(xì)胞內(nèi)的水分逐漸透出,從而減少了冰晶的形成,從而避免細(xì)胞的損傷。這就是為什么低溫凍存細(xì)胞時(shí)為什么要采用慢凍的一個(gè)重要原因。

一旦從生長(zhǎng)培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到冷凍培養(yǎng)基中,就要執(zhí)行慢凍的過程。盡管冷凍細(xì)胞系是通常執(zhí)行的程序,但是當(dāng)沒有合適的冷凍器具時(shí),或者由于存在血清,額外洗滌或操作不當(dāng)時(shí),就會(huì)出現(xiàn)問題。當(dāng)然,這個(gè)問題是在細(xì)胞復(fù)蘇(快融)后才發(fā)現(xiàn)的。發(fā)現(xiàn)復(fù)蘇后的細(xì)胞大部分或者全部都是死細(xì)胞,甚至還有不容易發(fā)現(xiàn)的整個(gè)凍存過程的不當(dāng)導(dǎo)致的細(xì)胞分化。所有這些問題和擔(dān)憂,都可以通過BambankerTM細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基試劑家族來解決。 BambankerTM的成分允許直接將細(xì)胞在-80°C或液氮中冷凍保存,從而避免了對(duì)額外設(shè)備的需求,并且也避免了耗時(shí)且復(fù)雜的梯度逐漸冷凍方案。




產(chǎn)品特色

• 可在-80°C或-196°C的溫度下長(zhǎng)期凍存細(xì)胞

• 非常適合雜交瘤細(xì)胞和高通量(HTP)應(yīng)用

• Bambanker Direct可以直接加到細(xì)胞中--無需洗滌且無需離心

• 細(xì)胞復(fù)蘇后的活率高

• 即用型冷凍介質(zhì)–無需程序或順序降溫冷凍

• 無血清–無污染風(fēng)險(xiǎn)

• 保質(zhì)期長(zhǎng)

天生為了雜交瘤(Born for hybridomas)


某些細(xì)胞類型(例如雜交瘤)對(duì)過度處理和操縱表現(xiàn)出更高的敏感性。 在長(zhǎng)期儲(chǔ)存和凍融循環(huán)后,這些細(xì)胞通常表現(xiàn)出更高的死亡率或不想要的分化。 Bambanker Direct正是針對(duì)這些類型的細(xì)胞而開發(fā)的,以提供嚴(yán)格的環(huán)境控制。 通過取消離心步驟,現(xiàn)在可以在添加新型冷凍保護(hù)劑Bambanker Direct后立即冷凍細(xì)胞以長(zhǎng)期保存。 只需將Bambanker Direct一對(duì)一地添加到培養(yǎng)板孔中,然后直接放入冰箱即可。 與原始Bambanker一樣,Direct版本也沒有血清,因此對(duì)于動(dòng)物來源的血清可能是一個(gè)問題的細(xì)胞來說非常有用。 通過使用Bambanker Direct,雜交瘤細(xì)胞可在-80°C長(zhǎng)期保存后復(fù)蘇率高達(dá)100%。


血清增加了長(zhǎng)期儲(chǔ)存的差異(Serum adds variation to long-term storage)


所有BambankerTM產(chǎn)品均不含血清。含有血清的冷凍保存培養(yǎng)基具有回收率波動(dòng)和成分不確定的缺點(diǎn)。凍存于含血清的培養(yǎng)基中的細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性可能會(huì)受到批次之間血清差異的影響,因?yàn)榈鞍踪|(zhì)和其他生物分子的組成和濃度會(huì)隨每批血清而變化。解凍和使用這種含血清培養(yǎng)基的細(xì)胞時(shí),可能會(huì)導(dǎo)致問題。因?yàn)锽ambankerTM的每種成分都經(jīng)過精確定義,因此您可以放心,在不同時(shí)間存儲(chǔ)的細(xì)胞都將有一致的效率。



BambankerTM可防止不期望的分化(BambankerTM prevents undesired differentiation)


不期望的細(xì)胞分化也可能是冷凍細(xì)胞長(zhǎng)期保存的一個(gè)問題。 所有Bambanker試劑均旨在大程度地減少此問題。 對(duì)于特別麻煩的細(xì)胞,Bambanker不含DMSO的配方經(jīng)過特殊配制,可防止可能與含DMSO的冷凍保存試劑相關(guān)的問題。 因此,請(qǐng)加入越來越多的實(shí)驗(yàn)室的選擇,使用Bambanker保護(hù)其細(xì)胞系!


多能干細(xì)胞的細(xì)胞活力和ALP染色 

                    上排:解凍兩天后檢測(cè)到大量細(xì)胞。 解凍后細(xì)胞沒有形態(tài)變化 

                    下排:BambankerTM不會(huì)引起細(xì)胞分化,因?yàn)樗袃鼋Y(jié)的干細(xì)胞仍會(huì)產(chǎn)生高水平的堿性磷酸酶,這是多能干細(xì)胞的報(bào)告基因


細(xì)胞凍存液家族(Family of BambankerTM)


Bambanker 細(xì)胞凍存液-細(xì)胞凍存、解凍操作步驟


?凍存操作步驟:慢凍


①從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)中處于對(duì)數(shù)增殖期的細(xì)胞。※凍存對(duì)數(shù)增殖期的細(xì)胞,是可以確保細(xì)胞良好生存率中最重要的一點(diǎn)。 

②使用部分細(xì)胞用臺(tái)盼藍(lán)染色(檢測(cè)活率)并計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量。 

③將含細(xì)胞的培養(yǎng)基移至離心管中,在合適條件(低離心力,必要低溫)下進(jìn)行離心。 

④去除上清液后,將細(xì)胞沉淀通過輕柔旋渦操作進(jìn)行懸浮。 

⑤每個(gè)凍存管中細(xì)胞數(shù)要保持規(guī)定濃度,然后再添加凍存液。 (每 1mLBambanker凍存液可凍存 5×105~1×107 個(gè)細(xì)胞)※⑤之后的操作步驟盡可能快速完成。另外,Bambanker凍存液從冷藏柜取出后,直接使用,無須平衡室溫,盡快進(jìn)行保存處理 。

⑥無需預(yù)冷細(xì)胞懸浮液,直接置于-80℃下保存。 

⑦保存液氮時(shí),先在-80℃保存 12 小時(shí)(超過一晚),待狀態(tài)穩(wěn)定后在移至液氮中保存。※轉(zhuǎn)移細(xì)胞時(shí)請(qǐng)盡快完成操作。 


?解凍操作步驟:快融 

①在 37℃恒溫箱(或者37℃水浴鍋)等設(shè)備中解凍細(xì)胞,確認(rèn)凍存管中液體融解。※此操作需迅速進(jìn)行。因?yàn)榧?xì)胞在解凍過程過極易受到損壞。

②將溶解的細(xì)胞液轉(zhuǎn)移到含有培養(yǎng)基的15ml無菌離心管中,混合后在規(guī)定條件下進(jìn)行離心 (比如:300~400×g) 

③去除上清液后,加入少量培養(yǎng)基,將細(xì)胞沉淀通過輕柔旋渦操作進(jìn)行懸浮。 

④混勻后,取出其中一部分細(xì)胞用臺(tái)盼藍(lán)染色(檢測(cè)活率)并計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量。

⑤將混勻的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)容器中,細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。


常見問題(FAQ)


Q1. Bambanker凍存液可以使用的最小體積是多少?


對(duì)于1*106個(gè)細(xì)胞,建議使用1 mL,對(duì)于較少的細(xì)胞,您可以減少Bambanker的用量。 例如,對(duì)于5×105,請(qǐng)使用0.5 mL。


Q2. Bambanker凍存液是否包含DMSO?


除Bambanker DMSO-Free(BBF01)外,Bambanker的其他三種均包含DMSO。


Q3. 復(fù)蘇培養(yǎng)時(shí),我們可以在不進(jìn)行細(xì)胞洗滌的情況下直接在培養(yǎng)基中使用解凍的細(xì)胞嗎?

 是的,您不需要清洗步驟。


Q4. 可以將在Bambanker中冷凍的細(xì)胞用于提取RNA嗎?

可以。 但是請(qǐng)注意,每個(gè)試管中的細(xì)胞數(shù)少(1*106個(gè)細(xì)胞)可能會(huì)導(dǎo)致分離出的RNA少。


Q5. 我們可以使用Bambanker進(jìn)行PBMC的冷凍保存嗎?

可以,


PBMC凍存的一個(gè)案例:

實(shí)驗(yàn)方案:

i)從健康人的血液中分離出PBMC

ii)PBMC在Bambanker(標(biāo)準(zhǔn)版)中冷凍,并在-80°C和-196°C(液氮)中以1×10 ^ 6細(xì)胞/個(gè)保存12個(gè)月。 1mL Bambanker 1mL等分試樣

iii)冷凍后十二個(gè)月,快速融化細(xì)胞并測(cè)量細(xì)胞數(shù),然后使用包被抗CD3抗體的T-25培養(yǎng)瓶和含IL-2(700 U / mL)的培養(yǎng)基培養(yǎng)7天。在第5、6和7天測(cè)量細(xì)胞計(jì)數(shù),并在培養(yǎng)的第7天進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果:

在-80°C下保存12個(gè)月,回收率59.5%;存活率88.9%

儲(chǔ)存在液氮中(-196°C)保存12個(gè)月,回收率63.9%;存活率87.3%

回收率=解凍后完整細(xì)胞數(shù)/最初凍存的細(xì)胞數(shù);存活率=在設(shè)定的檢測(cè)時(shí)間點(diǎn),通過臺(tái)盼藍(lán)測(cè)定的活細(xì)胞在總細(xì)胞中所占的百分比。


Q6. 您建議如何處理特別脆弱/敏感的細(xì)胞?

冷凍技巧:冷凍敏感細(xì)胞的最佳方法是將細(xì)胞放入Bambanker(選擇合適的類型)中,并在處理過程中將其保持在4°C。將它們盡可能快地放入-80°C的冰箱中24h。然后,將細(xì)胞儲(chǔ)存在-80°C或?qū)⒗鋬龅募?xì)胞轉(zhuǎn)移至液氮中。

解凍技巧:將小瓶放入37°C水浴中,直到內(nèi)容物融化為止。然后應(yīng)立即將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至大量預(yù)熱的培養(yǎng)基中-對(duì)于最敏感的細(xì)胞類型(干細(xì)胞,原代細(xì)胞),逐滴添加以保持活力。盡管某些細(xì)胞可以通過離心沉淀,然后再用移液器輕輕重懸,然后添加到裝有預(yù)熱生長(zhǎng)培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,但對(duì)于大多數(shù)敏感細(xì)胞類型,將它們?nèi)诨笾苯右迫肱囵B(yǎng)瓶中的操作更為溫和。第二天進(jìn)行培養(yǎng)基更換,以除去任何殘留的防凍劑。


Q7. 我們可以使用Bambanker冷凍保存整個(gè)類器官嗎?

是的,Bambanker和Bambanker HRM是您的選擇。 兩者均可提供超過70%的恢復(fù)率。 我們建議每個(gè)冷凍管使用少量類器官(低于20 mg)。 我們還建議您先將類器官在4°C的Bambanker中浸泡10分鐘,然后再冷凍。 將正常Bambanker用于類器官,將Bambanker HRM用于人類臨床試驗(yàn)或人類組織衍生的類器官。


Q8. Bambanker可以用于果蠅嗎?

只要是凍存單個(gè)細(xì)胞,就沒有問題。 我們沒有凍存整個(gè)生物體的經(jīng)驗(yàn)。


Q9.我可以使用Bambanker凍存受感染細(xì)胞中的病毒嗎?

只要細(xì)胞保持健康,這沒問題。


Q10. 我可以直接使用Bambaker而不用將其恢復(fù)室溫(RT)嗎?

沒問題,可以直接使用。


Q11. 如何使用Bambanker提高類器官的生存率? 我們使用20毫克的胃和結(jié)腸組織。

您可以將正常Bambanker用于動(dòng)物組織。 另外,我們建議將組織細(xì)化到20毫克以下。 您也可以在冷凍之前將組織在4°C的Bambanker中浸泡10分鐘。



Q12. 為什么我使用了Bambanker來保存細(xì)胞,但是存活率依然不高?

請(qǐng)凍存前確保細(xì)胞處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期,并且凍存時(shí)細(xì)胞數(shù)目控制在5×105~1×107/mL凍存液。


Q13. 我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)有固定的凍存程序了,如果換了你們的Bambanker,可以還繼續(xù)用原來程序降溫的方法凍存嗎?

雖然本產(chǎn)品可以無需程序降溫凍存細(xì)胞,但如果通過程序降溫盒等適當(dāng)控制了溫度下降的速度,效果更佳(如虎添翼)。


Q14. 哪些細(xì)胞株(系)適合使用Bambanker來進(jìn)行細(xì)胞冷凍保存?

幾乎所有細(xì)胞株(系)都可以使用Bambanker進(jìn)行凍存。對(duì)于較為寶貴的ES/iPS細(xì)胞的保存尤其適用。上所列舉的細(xì)胞系均已經(jīng)過測(cè)試驗(yàn)證。

但也并不排除可能有某些細(xì)胞株是不適合使用Bambanker來進(jìn)行凍存的,用戶在沒有確認(rèn)是否可使用時(shí),建議在進(jìn)行正式細(xì)胞凍存之前先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。


Q15. 無血清凍存液相比傳統(tǒng)含血清凍存液有什么優(yōu)勢(shì)?

無血清凍存液因不含有動(dòng)物血清,質(zhì)量更穩(wěn)定,批間差更小;同時(shí)未知生物成分或感染性物質(zhì)污染細(xì)胞的幾率也極低,尤其對(duì)于ES/iPS細(xì)胞等有可能用于再生醫(yī)療的細(xì)胞安全得以嚴(yán)格保障;可以直接凍存無血清培養(yǎng)的細(xì)胞,免去無血清再馴化的步驟;另外Bambanker無血清細(xì)胞凍存液不需要像傳統(tǒng)的血清凍存液那樣需要程序降溫,減少了用戶的繁瑣操作,節(jié)省了時(shí)間。


Q16. Bambanker在冷凍保存細(xì)胞的過程中起什么作用?

無血清細(xì)胞凍存液使用了DMSO(DMSO-Free除外)等作為保護(hù)劑,在凍存細(xì)胞時(shí)能以1℃/min左右的溫度下降而逐漸凍存,在此過程中,細(xì)胞內(nèi)的水分子被置換成保護(hù)劑,抑制胞內(nèi)和細(xì)胞周邊的冰晶的形成,防止細(xì)胞膜和細(xì)胞器結(jié)構(gòu)損傷,防止蛋白變性。





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