雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（高敏型）說明書

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產品詳情

產品描述

 報告基因檢測常用于研究真核生物基因表達調控，螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶可以分別催化底物螢光素(luciferin)和腔腸素(coelenterazine)發出生物螢光(bioluminescence)，這種發光反應具有良好的光學特征和濃度線性范圍，同時檢測的靈敏度高，可達到 10-20mol。兩種催化反應最適濃度不同，因此互不干擾，配合使用形成一套高靈敏的雙熒光素酶報告基因檢測系統，其中海腎螢光素酶常作為內參照。

  螢火蟲螢光素酶是一種分子量約為 61 kDa 的蛋白，在 ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下，催化 luciferin 氧化成 oxyluciferin，在此過程中會產生發射波長 560 nm 的生物螢光。海腎螢光素酶是一種分子量約為36 kDa的蛋白，在氧氣存在條件下，催化腔腸素(Coelenterazine) 氧化成 coelenteramide，在此過程中會發出波長約為 480 nm 的生物螢光。在后加入海腎螢光素酶底物時，可有效淬滅螢火蟲熒光素酶催化 luciferin 的發光，而不干擾海腎螢光素酶的活性，從而實現雙螢光素酶報告基因檢測。生物螢光可以通過化學發光儀(luminometer)或) 或多功能酶標儀進行測定。通過螢光素酶與其底物催化發光的體系，可以高效、靈敏地檢測目的基因的表達。

產品組分

使用方法

使用方法

1. 試劑準備：

（1）1x Universal lysis Buffer 配置：取所需體積的 5x Universal lysis Buffer 臨用前用三蒸水稀釋至 1x 用；

（2）Fluc buffer A 工作液：試劑盒開啟時，將 Fluc buffer A 全部加入到 Fluc substrate中，適當吹打搖勻至粉末充分溶解后分裝到棕色管中-20℃保存備用；

（3）Rluc Buffer B 工作液：臨用前取 50x Rluc substrate 用 Rluc Buffer B 稀釋至 1x 用（按需配置），配置好的 Rluc Buffer B 工作液在 2-3 h 內使用有效。（試劑配置過程中注意避光）

2. 細胞裂解物制備:

棄去培養板中的培養液，加入足量 PBS 清洗一遍，細胞刮刮取收集沉淀(如為懸浮細胞直接離心棄上清收集沉淀)。細胞沉淀可-80℃保存，也可立即加入適量 1x Universal lysis Buffer 吹打混勻，液氮凍融三次，制備細胞裂解物。

細胞裂解液推薦使用量：

3. 螢光數值檢測：

（1）熒光酶標儀設定， 選擇生物發光檢測功能，根據本批樣本的靈敏度選擇合適增益與積 分時間，默認為增益 135，積分時間 10 s。

（2）檢測：

1) 移液槍吸取細胞裂解液 20 μL 到黑色孔板底部（充分混勻裂解物）；

2) 加入 100 μL Fluc buffer A，移液器輕柔快速吹打混勻三次，立即啟動檢測，記錄發光值 （F 值）；

3)加入 100 μL Rluc buffer B，移液器輕柔快速吹打混勻三次，立即啟動檢測，記錄發光值（R 值）。（因手動控制檢測會導致時間誤差較大，對結果有一定的影響，建議配備計時器，保證不同 樣本之間反應和檢測時長基本一致)

4.數據分析：

（1）實驗設計：根據實驗目的，每組實驗均應設置空白對照組，對照組和處理組。

a.空白對照組

背景 F：未轉染細胞裂解液+ Fluc buffer A。

背景 R：未轉染細胞裂解液+ Fluc buffer A + Rluc buffer B。

注：空白對照組樣品量須與實驗樣品量相同，且與實驗樣品含有相同的培養基/血清組合。

b. 對照組：轉染細胞未經實驗因素處理 (即對照組 F 和對照組 R)。

c. 實驗組：轉染細胞經實驗化合物處理 (即實驗組 F 和實驗組 R)。

計算結果：對照組比值=(對照組 F-背景 F)/(對照組 R-背景 R)，

實驗組比值=(實驗組 F-背景 F）/(實驗組 R-背景 R)。

表達倍數=實驗組比值/對照組比值。

圖 2.熒光素酶報告基因檢測試劑盒操作示意圖

實驗案例分析

在六孔板中接種適量細胞過夜至貼壁狀態，第二天用新鮮的空白培養基饑餓細胞 4h 后共轉三個質粒：

1.含有法尼醇 X 受體（FXR）啟動子區的熒光素酶報告基因表達載體質粒；

2.含有 FXR 啟動子區轉錄因子 E2 功能區的表達載體質粒；

3.海參熒光素酶重組表達載體質粒。轉染 6h 后更換為含有不同藥物濃度的鵝去氧膽酸（Chenodeoxycholic acid，CDCA）和奧貝膽酸（Ocaliva，OCA）和Complete culture solution培養細胞 48h，最后按試劑盒說明書操作刮收沉淀，隨后立即裂解進行熒光素酶報告基因活性檢測，結果如下:

圖 3（左）兩個濃度（10μM，20 μM）CDCA 藥物處理下，FXR 啟動子區熒光素酶報告基因激動倍數圖；

  （右）兩個濃度（10μM，20 μM）OCA 藥物處理下，FXR 啟動子區熒光素酶報告基因激動倍數圖

  （紅色：起發生物品牌產品測定結果；黃色：進口“P"品牌產品測定結果）。

注意事項

（1）反應溫度：酶促反應對溫度較為敏感，加樣檢測前務必將檢測試劑以及細胞培養液平衡至室溫（20-25℃）。

（2）檢測儀器：能檢測化學發光的儀器都適用，但由于不同儀器的設置和靈敏度不同，測得的光信號值也會不同。

    檢測板：為防止孔間干擾，推薦使用不透光酶標板。

（3）發光信號會受到檢測環境如培養基組分、溫度等影響，應確保同組內不同樣本檢測條件一致。

（4）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套。

（5）本產品僅作科研用途！