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agrisera AS08 300說明書

更新時(shí)間:2020-12-01      點(diǎn)擊次數(shù):2232

 

 

Agrisera抗體

產(chǎn)生針對(duì)在各種物種中在靶蛋白中保守的肽的整體抗體。這種智能設(shè)計(jì)可生成在各種物種之間具有定量靶標(biāo)識(shí)別的抗體。一些抗體會(huì)從高等植物,苔蘚,藻類和硅藻中檢測(cè)到相同的蛋白質(zhì)。全局抗體可以與匹配的全局定量標(biāo)準(zhǔn)一起使用, 這將允許準(zhǔn)確測(cè)量來自定義分類范圍內(nèi)許多物種的靶蛋白水平。抗體識(shí)別區(qū)域在標(biāo)準(zhǔn)品和被分析的樣品蛋白質(zhì)中是相同的。  

應(yīng)用范圍

•以標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)效率從多種來源檢測(cè)主要蛋白質(zhì),包括藍(lán)細(xì)菌,浮游植物或植物等未鑒定物種。
•當(dāng)混合水平的光合蛋白質(zhì)來源存在時(shí),跟蹤植物或浮游植物中的環(huán)境適應(yīng)情況。
•跟蹤或預(yù)測(cè)社區(qū)主要光合作用和生物合成過程的大能力。

參考文獻(xiàn) “使用抗體在植物科學(xué)中進(jìn)行定量免疫印跡”,使用全局抗體分析未鑒定物種或混合微藻群落中的光合復(fù)合物。植物生理學(xué)報(bào),2003:119:322-327。

 agrisera AS08 300說明書

1 | PEB(4x)| 蛋白質(zhì)提取緩沖液


AS08 300   | 用于從植物組織和藻類/細(xì)菌細(xì)胞中定量分離總可溶性/膜蛋白的提取緩沖液,已優(yōu)化用于變性條件下的后續(xù)western blot檢測(cè)

 

數(shù)量 5 x 2 ml(4x儲(chǔ)備液)多可分離75種植物材料(對(duì)于100 mg新鮮重量,使用500 µl 1x PEB)或190種藻類材料(對(duì)于總4-10 µg的細(xì)胞量,使用200 µl 1x PEB)葉綠素)

存儲(chǔ) 在室溫下穩(wěn)定至少1個(gè)月;在4°C下短期存儲(chǔ)(6個(gè)月),在-20°C下長(zhǎng)期存儲(chǔ)(1年或更長(zhǎng)時(shí)間)

經(jīng)過測(cè)試的應(yīng)用 蛋白質(zhì)提取

 確認(rèn)反應(yīng)性 PEB已在來自高等植物,苔蘚,地衣,藻類,硅藻,鞭毛藻,藍(lán)細(xì)菌的各種物種和組織上進(jìn)行了測(cè)試。提取物可以使用去污劑(LDS)兼容的方法進(jìn)行定量,并且在隨后的SDS PAGE凝膠電泳,蛋白質(zhì)印跡和免疫沉淀(IP)中已顯示出高度可重復(fù)和定量的結(jié)果。

大多數(shù)Agrisera商業(yè)抗體都在用該緩沖液提取的植物或藻類樣品上進(jìn)行測(cè)試。

 應(yīng)用實(shí)例 

開始之前,
通過在無菌去離子水中稀釋4x儲(chǔ)備液為所有樣品準(zhǔn)備足夠的1x PEB(1x PEB的pH值應(yīng)在8.25和8.75之間)。建議在準(zhǔn)備立即使用的1x PEB時(shí),從新鮮原料中加入蛋白酶抑制劑(此緩沖液不提供),以增加提取物中未降解蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。我們建議從新鮮制備的50x儲(chǔ)備液(以1x PEB)中加入1:50體積/體積,以得到制造商推薦的所需終濃度(例如,羅氏公司的Pefabloc SC為0.1 mg / ml)。

 

所需1x PEB的總體積取決于樣品類型和所用組織的數(shù)量:對(duì)于100 mg新鮮植物組織,我們建議使用500 µl 1x PEB。對(duì)于藻類樣品(相當(dāng)于4-10 µg總?cè)~綠素),我們建議200 µl 1x PEB。已發(fā)現(xiàn)將樣品體積保持在0.2-0.5 ml范圍內(nèi)有助于獲得更好的提取結(jié)果,不建議將樣品體積增大。
 

材料準(zhǔn)備

植物組織:稱重并在液氮中速凍,并在-80°C下儲(chǔ)存直至加工。
藻類培養(yǎng)物:離心形成沉淀或在過濾器(例如GF / F或聚碳酸酯)上收集并在-80°C冷凍直至進(jìn)行處理。



 萃取

1個(gè)  

在帶有杵的預(yù)冷研缽中將液態(tài)N 2中的冷凍材料研磨成細(xì)粉,然后轉(zhuǎn)移到1.5 ml試管中

在研磨過程中隨時(shí)保持物料冷卻,避免溢出

2  

加入1x PEB,立即將樣品冷凍在液體N 2中

對(duì)于100 mg植物組織為500 µl,對(duì)于細(xì)胞為200 µl(相當(dāng)于4-10 µg總?cè)~綠素);保持試管直立以將樣品固定在試管底部

3  

小心地對(duì)樣品進(jìn)行超聲處理,直到樣品融化為止,立即將樣品重新浸入液體N 2中以避免加熱

使用微超聲儀(例如Branson Ultrasonics 450型)在約30%的低設(shè)置下可獲得佳結(jié)果;也可以使用水浴超聲儀,盡管這可能導(dǎo)致可再現(xiàn)的蛋白質(zhì)回收率略有降低;

4  

根據(jù)不同的物種重復(fù)超聲處理(3),置于冰上,直到處理完所有樣品

對(duì)于高等植物,2-3個(gè)周期,藍(lán)細(xì)菌3個(gè)周期,衣藻2個(gè)周期,異源,ThalassiosiraTrichodesmium 1個(gè)周期

5  

將樣品以10000 xg離心3分鐘以除去不溶物和未破碎的細(xì)胞,沉淀應(yīng)為白色/淺灰色

沉淀的深綠色表示破碎不是佳的,需要使用新樣品調(diào)整提取條件(例如,改進(jìn)研磨和/或重復(fù)超聲處理步驟)

6  

用移液管將上清液轉(zhuǎn)移到新管中,注意不要帶走雜物

預(yù)計(jì)植物的上清液約為400 µl,藍(lán)藻/藻類樣品的約為150 µl;用移液器收集上清液,因?yàn)? x 200(或2 x 75 µl)降低了干擾沉淀的碎片的風(fēng)險(xiǎn)

蛋白質(zhì)測(cè)定
使用去污劑相容性測(cè)定法測(cè)定回收的上清液的總蛋白質(zhì)含量。根據(jù)所用物種的數(shù)量和/或組織,您可能期望蛋白質(zhì)含量為1.5-6 µg / µl。


儲(chǔ)存
蛋白質(zhì)提取物可在+ 4°C下保存24小時(shí),或在-20°C / -80°C下保存長(zhǎng)達(dá)6/12個(gè)月。我們建議分裝樣品。重新冷凍蛋白質(zhì)樣品可能會(huì)導(dǎo)致降解/聚集。


裝載在凝膠上
應(yīng)將新鮮制備的還原劑(例如二硫蘇糖醇,終濃度為50 mM)添加到準(zhǔn)備裝載的體積中。在70°C加熱5分鐘,短暫旋轉(zhuǎn)并加樣在凝膠上。0.5-5 µg /泳道的蛋白質(zhì)負(fù)載量應(yīng)足以滿足大多數(shù)Western Blot應(yīng)用的要求。

 

 附加信息 

緩沖液成分(4x):包含?40%v / v甘油[HOCH 2 CH(OH)CH 2 OH],Tris-HCl [NH 2 C(CH 2 OH)3·HCl] pH 8.5,LDS [CH 3( CH 211 OSO 3 Li],EDTA [(HO 2 CCH 22 NCH 2 CH 2 N(CH 2 CO 2 H)2]
 

建議在準(zhǔn)備立即使用的1x PSB時(shí)包括新鮮制備的蛋白酶抑制劑(此緩沖液不提供)。
 

PEB已針對(duì)從植物/藻類組織中提取全蛋白質(zhì)提取物的定量小規(guī)模制備進(jìn)行了優(yōu)化。使用以下描述的程序進(jìn)行提取將獲得大的蛋白質(zhì)產(chǎn)量,并減少蛋白質(zhì)的降解和聚集。

提取物可使用與??去污劑(LDS)兼容的方法進(jìn)行定量,并在隨后的SDS PAGE凝膠電泳,蛋白質(zhì)印跡和免疫沉淀中顯示出高度可重復(fù)和定量的結(jié)果。

PEB已在來自高等植物,苔蘚,地衣,藻類,硅藻,鞭毛藻和藍(lán)細(xì)菌的多種物種和組織上進(jìn)行了測(cè)試。

 

 背景 

PEB是一種提取緩沖液,用于破壞和溶解植物組織和藻類細(xì)胞中的總蛋白。與其他破壞細(xì)胞的方法相比,將陰離子去污劑LDS與推薦的程序(超聲處理和冷凍/融化循環(huán)的組合)結(jié)合使用可增加溶解的和未降解的蛋白質(zhì)的數(shù)量(請(qǐng)參閱參考資料)。對(duì)于1-2個(gè)樣品,推薦步驟的預(yù)計(jì)動(dòng)手時(shí)間為20-30分鐘。預(yù)期的產(chǎn)量將為1.5-6 µg / µl總蛋白(從標(biāo)準(zhǔn)程序中回收),具體取決于原料,例如其生物學(xué)階段,使用的均質(zhì)化方法(打漿機(jī)與超聲處理)。

 

 

 

 

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