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KAMIYA KT-26867說明書

更新時間:2020-08-06      點擊次數(shù):1837

KAMIYA KT-26867說明書

 

KAMIYA BIOMEDICAL COMPANY

人蛋白零點,髓鞘 (MPZ) ELISA

用于定量測定組織勻漿、細胞培養(yǎng)上清液和其他生物體液中的人 MPZ

目錄號編號KT-26867

僅供研究使用。不得用于診斷程序。

產(chǎn)品信息

人蛋白零點,髓鞘 (MPZ) ELISA

目錄號編號KT-26867

 

Human Protein Zero, Myelin

(MPZ) ELISA

 

預(yù)期用途

該試劑盒是一種夾心酶免疫分析法,用于體外定量測定組織勻漿、細胞培養(yǎng)上清液和其他生物體液中的人 MPZ。僅供研究使用。不適用于  用于診斷程序。

 

組件

 

試劑

數(shù)量

預(yù)包被、即用型 96 孔板條板

1

校準品(凍干)

2

校準品稀釋液

1 × 20 mL

檢測試劑 A

1 × 120 µL

檢測試劑 B

1 × 120 µL

試驗稀釋劑 A(2X 濃縮液)

1 × 6 mL

試驗稀釋劑 B(2X 濃縮液)

1 × 6 mL

TMB 底物

1 × 9 mL

終止液

1 × 6 mL

清洗緩沖液(30X 濃縮液)

1 × 20 mL

96 孔封板膜

4

需要但未提供的材料

  • 帶有 450±10 nm 濾光片的酶標儀。
  • 精密單通道和多通道移液器和一次性吸頭。
  • 用于稀釋樣品的 Eppendorf 管。
  • 去離子水或蒸餾水。
  • 吸水紙吸干微量滴定板。
  • 清洗液容器。

 

儲存

所有試劑應(yīng)根據(jù)小瓶上的標簽進行保存。接收后,校準品、檢測試劑 A、檢測試劑 B 和 96 孔板條應(yīng)儲存在-20 ℃。未使用的試劑條應(yīng)保存在密封袋中,并提供干燥劑,以盡量減少暴露于潮濕空氣中。開封的檢測試劑盒將在所示失效日期前保持穩(wěn)定,前提是其按照上述規(guī)定儲存。

 

原理

該試劑盒中提供的微量滴定板已用 MPZ 特異性抗體預(yù)包被。然后將校準品或樣品加入到含有 MPZ 特異性生物素結(jié)合抗體制劑的適當微量滴定板孔中。然后,向每個微孔板小孔中加入與辣根過氧化物酶 (HRP) 結(jié)合的抗生物素蛋白并孵育。然后向各孔中加入 TMB 底物溶液。只有那些含有 MPZ、生物素偶聯(lián)抗體和酶偶聯(lián)抗生物素蛋白的孔才會出現(xiàn)顏色變化。

 

加入硫酸溶液終止酶-底物反應(yīng),并采用分光光度法在 450 nm±10 nm 波長處測定顏色變化。然后通過比較樣品的 O.D. 值與校準曲線,測定樣品中 MPZ 的濃度。

 

 

樣本采集和儲存

 

組織勻漿

組織勻漿的制備因組織類型而異。對于本試驗,在冰冷 PBS (0.02 mol/L,pH 7.0-7.2) 中沖洗組織,以*除去過量血液,并在勻漿前稱重。將組織制成小塊,置于冰上,用玻璃勻漿器在 5-10 mL PBS 中勻漿化(Micro tissue Grinders 也工作)。用超聲細胞破碎儀對所得混懸液進行超聲處理或進行兩次凍融循環(huán)以進一步破碎細胞膜。然后,將勻漿在 5,000 xg 下離心 5 min。立即除去上清液并進行試驗,或等分并儲存在≤-20 ℃ 下。

 

細胞培養(yǎng)上清液和其他生物體液

以 1,000 xg 離心樣品 20 min。立即除去微粒并進行測定,或?qū)悠返确衷嚇觾Υ嬖?20 ℃ 或-80 ℃ 下備用。避免反復(fù)凍融循環(huán)。

注:

1. 5 天內(nèi)使用的樣品可在 4 ℃ 下儲存,否則樣品必須在-20 ℃(≤1 個月)或-80 ℃(≤2 個月)下儲存,以避免生物活性損失和污染。

  • 樣本溶血會影響結(jié)果,因此溶血標本無法檢出。
  • 進行分析時,將樣品緩慢恢復(fù)至室溫。

 

試劑制備

使用前,將所有試劑盒組分和樣本置于室溫 (18-25 ℃) 下。

 

校準品

用 0.1 mL 校準品稀釋液復(fù)溶校準品,在室溫下保持 10 min,輕輕振搖(不要起泡)。儲備液中校準品的濃度為 10 ng/mL。請制備 7 支含 0.5 mL 校準品稀釋液的試管,并根據(jù)下圖制備雙倍稀釋系列。在下一次轉(zhuǎn)移前,充分混合各試管。設(shè)置 7 個點的稀釋校準品,如 10 ng/mL、5 ng/mL、2.5 ng/mL、1.25 ng/mL、0.625 ng/mL、0.312 ng/mL、0.156 ng/mL,后一個含有校準品稀釋液的 EP 管作為空白 (0 ng/mL)。

 

 

 
 

 

 

 

1

2

3

4

5

6

7

8

ng/mL

10

5

2.5

1.25

0.625

0.312

0.156

0

 

試驗稀釋劑 A 和 B

用 6 mL 去離子水或蒸餾水稀釋 6 mL 試驗稀釋劑 A 或 B 濃縮液 (2X),制備 12 mL 試驗稀釋劑 A 或 B。制備的工作稀釋液不能冷凍。

 

檢測試劑 A 和 B

使用前短暫旋轉(zhuǎn)或離心儲備檢測試劑 A 和檢測試劑 B。分別用工作試驗稀釋劑 A 或 B 稀釋至工作濃度 (1:100)。

 

清洗溶液

用 580 mL 去離子水或蒸餾水稀釋 20 mL 清洗液濃縮液 (30X),制備 600 mL 清洗液 (1X)。

 

TMB 底物

用無菌吸頭吸取所需劑量的溶液,不得將殘留溶液再次倒入小瓶中。

 

 
 

 

 

注:

1. 不允許在孔中直接進行連續(xù)稀釋。

2. 在測定前 15 min 內(nèi)制備校準品。請勿在 37 ℃ 下直接溶解試劑。

  • 請按照說明仔細復(fù)溶校準品或工作檢測試劑 A 和 B,避免起泡并輕輕混合,直至晶體*溶解。為盡量減少移液引起的不精密度,應(yīng)使用小體積并確保移液器經(jīng)過校準。建議抽吸 10µL 以上,用于一次移液。

4. 復(fù)溶的校準品、檢測試劑 A 和檢測試劑 B 只能使用一次。

5. 如果在清洗溶液濃縮液 (30X) 中形成晶體,則加熱至室溫并輕輕混合,直至晶體*溶解。

6. 試劑配制用水或容器受污染會影響檢測結(jié)果。

 

 

樣品制備

  • Kamiya Biomedical Company 僅對試劑盒本身負責,不對檢測過程中消耗的樣本負責。用戶應(yīng)計算整個測試中可能使用的樣本數(shù)量。請?zhí)崆邦A(yù)留足夠的樣本。

 

2. 請在測定前預(yù)測濃度。如果這些值不在校準曲線范圍內(nèi),則用戶必須確定其特定實驗的樣本稀釋度。

 

3. 如果手冊中未指明樣本,則需要進行初步實驗以確定試劑盒的有效性。

 

4. 用化學(xué)裂解緩沖液制備的組織或細胞提取樣品,由于某些化學(xué)物質(zhì)的影響,可能會引起意想不到的 ELISA 結(jié)果。

 

  • 由于其他來源的抗原可能與我們試劑盒中使用的抗體不匹配(例如,抗體靶向構(gòu)象表位而不是線性表位),我們的產(chǎn)品可能無法識別其他生產(chǎn)商的一些天然或重組蛋白。

 

6. 受細胞活性、細胞數(shù)量和取樣時間等因素的影響,試劑盒可能無法檢測細胞培養(yǎng)上清液樣本。

 

7. 建議使用未經(jīng)長期儲存的新鮮樣本進行試驗。否則,這些樣品可能發(fā)生蛋白質(zhì)降解和變性,終導(dǎo)致錯誤的結(jié)果。

 

試驗程序

  • 測定稀釋校準品、空白和樣本孔。校準品制備 7 孔,空白制備 1 孔。向適當孔中分別加入 100µL 校準品稀釋液(讀取試劑制備液)、空白和樣本。用封板覆膜覆蓋。在 37 ℃ 下孵育 2 小時。

 

2. 清除每個孔中的液體,不要清洗。

 

  • 向各孔中加入 100µL 檢測試劑 A 工作溶液。用封板覆膜覆蓋后,在 37 ℃ 下孵育 1 小時。

 

  • 吸取溶液,使用噴射瓶、多通道移液器、歧管分配器或自動清洗器用 350µL 1X 清洗液清洗每個孔,靜置 1-2 min。通過將平板卡在吸水紙上,*去除所有孔中的剩余液體。重復(fù) 3 次。后一次洗滌后,通過抽吸或傾析去除任何剩余的洗滌緩沖液。倒置平板,在吸水紙上吸干。

 

  • 向各孔中加入 100µL 檢測試劑 B 工作溶液。用封板覆膜覆蓋后,在 37 ℃ 下孵育 30 min。

 

6. 按照步驟 4 重復(fù)抽吸/清洗過程 5 次。

 

  • 向各孔中加入 90µL 底物溶液。用新的封板機蓋住。在 37 ℃ 下孵育 15-25 min(不得超過 30 min)。避光保存。加入底物溶液后,液體將變?yōu)樗{色。

 

  • 向各孔中加入 50µL 終止液。加入終止液后,液體將變?yōu)辄S色。輕敲微孔板一側(cè),混勻液體。如果顏色變化不均勻,輕敲平板以確保充分混合。

 

  • 除去任何一滴水和平板底部的指紋,并確認液體表面無氣泡。然后,運行酶標儀,立即在 450 nm 處測定。

注:

  • 試驗制備:保留適當數(shù)量的條帶用于 1 次實驗,并從微量滴定板中取出額外的條帶。取出的試劑條應(yīng)重新密封,并在-20 ℃ 下儲存,直至試劑盒失效日期。
  • 樣本或試劑添加:請使用新鮮制備的校準品。請小心地將樣品加入孔中,并輕輕混合以避免起泡。盡可能不要接觸孔壁。對于程序中的每個步驟,將試劑或樣本添加到測定板的總分配時間不應(yīng)超過 10 min。這將確保每個移液步驟的運行時間相等,不會中斷。盡管不要求,但建議重復(fù)檢測所有校準品和標本。為避免交叉污染,在每個校準品水平添加之間、樣本添加之間和試劑添加之間更換移液器吸頭。此外,每種試劑使用單獨的儲液器。
  • 孵育:為確保結(jié)果準確,孵育步驟期間必須適當粘附封板覆膜。在各孵育步驟之間,請勿使微孔長時間處于未覆蓋狀態(tài)。試劑加入微孔板條后,在檢測過程中的任何時間都不要讓板條變干。必須觀察培養(yǎng)時間和溫度。
  • 清洗:清洗程序至關(guān)重要。每個步驟*去除液體對于良好性能至關(guān)重要。后一次清洗后,通過抽吸或傾倒除去任何剩余的清洗液,并除去平板底部的水滴和指紋。清洗不充分將導(dǎo)致精密度較差和吸光度讀數(shù)假性升高。
  • 反應(yīng)時間的控制:觀察加入 TMB 底物后顏色的變化(如 10 min 觀察一次),如顏色過深,應(yīng)提前加入終止液,避免反應(yīng)過強而導(dǎo)致吸光度讀數(shù)不準確。

6. TMB 底物容易被污染。請避光保存。

 

7. 小于 60% 的環(huán)境濕度可能會對終性能產(chǎn)生一些影響,因此,建議在該條件下使用濕化器。

 

結(jié)果計算

計算各校準品、質(zhì)控品和樣本重復(fù)兩次讀數(shù)的平均值,并減去平均零校準品光密度。在 log-log 圖形紙上創(chuàng)建校準曲線,y 軸為 MPZ 濃度,x 軸為吸光度。通過校準品點繪制擬合直線,可通過回歸分析確定。還建議使用一些 plot 軟件。如果樣本已被稀釋,則從校準曲線中讀取的濃度必須乘以稀釋因子。

 

性能

檢測范圍

0.156–10 ng/mL。

用于 ELISA 的校準曲線濃度為 10 ng/mL、5 ng/mL、2.5 ng/mL、1.25 ng/mL、0.625 ng/mL、0.312 ng/mL、0.156 ng/mL。

 

靈敏度

人 MPZ 的小可檢測劑量通常低于 0.052 ng/mL。本試驗的靈敏度或檢測下限 (LLD) 定義為可與零區(qū)分的低蛋白濃度。測定零校準品 20 次重復(fù)測定的平均 O.D. 值加上 3 個標準差。

 

特異性

該方法檢測人 MPZ 具有較高的靈敏度和*的特異性。未觀察到人 MPZ 和類似物之間存在顯著的交叉反應(yīng)性或干擾。

注:受當前技能和知識的限制,我們不可能完成人 MPZ 與所有類似物的交叉反應(yīng)檢測,因此交叉反應(yīng)可能仍然存在。

 

分析方法總結(jié)

1. 準備所有試劑、樣本和校準品;

2. 向每個孔中加入 100µL 校準品或樣本。在 37 ℃ 下孵育 2 小時;

3. 加入 100µL 制備好的檢測試劑 A。在 37 ℃ 下孵育 1 小時;

4. 抽吸并清洗 3 次;

5. 加入 100µL 制備好的檢測試劑 B。在 37 ℃ 下孵育 30 min;

6. 抽吸并清洗 5 次;

7. 加入 90µL 底物溶液。在 37 ℃ 下孵育 15-25 min;

8. 加入 50µL 終止液。立即在 450 nm 處讀數(shù)。

 

 

重要說明

1. 終的實驗結(jié)果將與終端用戶的操作技能和實驗環(huán)境密切相關(guān)。請確保有足夠的樣本可用。

  • 不同批次的試劑盒在檢測范圍、靈敏度和顯色時間上可能略有不同。請嚴格按照試劑盒隨附說明書進行實驗,同時使用我們網(wǎng)站的電子版(www.k-assay。。com)僅供參考。

3. 請勿將一批試劑盒中的試劑混合或替換為另一批試劑盒。僅使用制造商提供的試劑。

4. 儲存和孵育期間,所有試劑均應(yīng)避免強光照射。所有試劑瓶蓋應(yīng)蓋緊,防止微生物蒸發(fā)和污染。

 

  • 次開板時孔內(nèi)可能有一些霧狀物質(zhì)。不會對終試驗結(jié)果產(chǎn)生任何影響。在需要之前,請勿從儲存袋中取出微量滴定板。
  • 試劑制備和上樣過程中的錯誤操作,以及酶標儀參數(shù)設(shè)置不正確可能導(dǎo)致結(jié)果不正確。在 450±10 nm 波長下,帶寬為 10 nm 或更低、光密度范圍為 0-3 O.D. 或更高的酶標儀可用于吸光度測量。實驗前請仔細閱讀說明書并調(diào)整儀器。
  • 即使是同一個操作員也可能在兩個獨立的實驗中得到不同的結(jié)果。為了獲得更好的重現(xiàn)性結(jié)果,應(yīng)控制試驗中每個步驟的操作。此外,建議在各批次測定前進行初步實驗。
  • 每個試劑盒均通過了嚴格的質(zhì)量控制檢測。然而,由于一些非預(yù)期的運輸條件或不同的實驗室設(shè)備,終端用戶的結(jié)果可能與我們的內(nèi)部數(shù)據(jù)不一致。不同批次試劑盒之間的批內(nèi)方差也可能由上述因素引起。
  • 來自不同生產(chǎn)商的相同產(chǎn)品的試劑盒可能會產(chǎn)生不同的結(jié)果,因為我們尚未將我們的產(chǎn)品與其他生產(chǎn)商進行比較。
  • 建議與該試劑盒一起使用的終止液為酸性溶液。使用本材料時,請佩戴眼睛、手、面部和衣物。

 

 

 

僅供研究使用。不得用于診斷程序。

上海起發(fā)實驗試劑有限公司
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