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用于樹(shù)突和樹(shù)突棘浸染的GOLGT-COX染色系統(tǒng)-上海起發(fā)

更新時(shí)間:2019-06-24      點(diǎn)擊次數(shù):3266

用于樹(shù)突和樹(shù)突棘浸染的GOLGT-COX染色系統(tǒng)-上海起發(fā)

                            于體外研究

 

    Bioenno Golgi Kit是一種基于高爾基染色法設(shè)計(jì)出來(lái)的試劑盒,用于浸染神經(jīng)元樹(shù)突和樹(shù)突棘(參見(jiàn)下面的參考文獻(xiàn))。該試劑盒在大鼠小鼠兔和猴子以及人類(lèi)死亡后獲得的新鮮腦組織上進(jìn)行了廣泛多次的測(cè)試,確定了該試劑盒能將樹(shù)突和樹(shù)突棘穩(wěn)定和高質(zhì)量的染色(見(jiàn)圖A-C)。大多數(shù)神經(jīng)元根據(jù)組織年齡大小用該試劑盒浸漬需要7-14天(見(jiàn)表2)。試劑盒儲(chǔ)存室溫(4-25ºC)下的黑暗區(qū)域。

 

圖中為用Bioenno Golgi Kit侵染的樹(shù)突分支和樹(shù)突棘

(A):低倍率(4×物鏡)顯微鏡照,顯示海馬體中高爾基體浸漬的神經(jīng)元。

(B):從尾狀后肌取出的紋狀體神經(jīng)元。左側(cè)面板框架區(qū)域中的樹(shù)突棘(20×)右側(cè)圖片中放大顯示(箭頭,63×)。

(C):從皮質(zhì)采取的錐體神經(jīng)元。 中間面板框架區(qū)中樹(shù)突分支上的樹(shù)突棘(20×)被放大顯示 斜(左,100×)和 主(右,100×)。 這個(gè)階段常觀察到類(lèi)似絲狀偽足的突起(左側(cè)圖片的箭頭)。

 

參考文獻(xiàn):

• Ramón-Moliner E: The Golgi-Cox technique. In Nauta WJH and Ebbesson SOE (eds.), Contemporary Methods in Neuroanatomy. pp 32–55, New York: Springer, 1970.

• Glaser ME and Van der Loos H: Analysis of thick brain sections by obverse-reverse computer microscopy: application of a new,high clarity Golgi-Nissl stain. J Neurosci Methods 1981, 4:117–125.

• Kolb B, Ladowski R, Gibb R, Gorny G. Does dendritic growth underlie recovery from neonatal occipital lesions in rats? Behav Brain Res 1996, 77:125–133.

• Gibb R and Kolb B. A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain. J Neurosci Methods 1998, 79:1–4.

 

保質(zhì)期:套件中的物品保質(zhì)期為自購(gòu)買(mǎi)之日起的12個(gè)月之內(nèi)。

退貨政策:Bioenno Tech對(duì)此產(chǎn)品的退貨政策是自購(gòu)買(mǎi)之日起90天之內(nèi)。

 

隨套件提供的材料

•溶液A:浸漬溶液(240 ml×2瓶)。溶液A是工作液,在底部看到沉淀物是正常現(xiàn)象,實(shí)驗(yàn)只需使用其上清液。

•試劑B:用于制備兩種工作緩沖液。

緩沖液1:浸漬后緩沖液(30 g×5 瓶)制備方法:在90 ml dH2O中稀釋 30g 試劑B

緩沖液2:收集和安裝緩沖液(30 g×5 瓶)制備方法:在500 ml dH2O中稀釋30 g試劑B

工作緩沖液可在4ºC下儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)4周。

 

•溶液C:染色溶液(220 ml×2 瓶)。所提供的溶液C在使用前用dH2O(體積比為3:5)稀釋。

例如,18ml溶液C + 30ml dH2O→48ml工作液,試劑盒中提供染色罐可剛好裝下所制備的48ml工作液。 48ml工作液可用于多達(dá)120個(gè)切片(例如,在所提供的染色罐中總共有10個(gè)載玻片,每個(gè)載玻片黏附有12個(gè)鼠腦切片)。

 

•試劑D:復(fù)染緩沖液(90 g×2 瓶)。使用前需用dH2O稀釋試劑。

在500 ml dH2O中稀釋90 g試劑D形成工作液。工作液可在室溫下儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月。

48ml工作液可用于多達(dá)120個(gè)切片(例如,如上所述在染色罐中的12個(gè)切片×10個(gè)載玻片)。

 

•還包含:

著色筆(大,扁平,1 只),用于切片轉(zhuǎn)移;

圓頭筆(小,1 個(gè)),用于切片安裝;

帶蓋的染色罐(2個(gè)),用于存儲(chǔ),染色和清洗粘連在粘性顯微鏡載玻片上的切片。

 

套件不提供的必要材料:

蒸餾水或去離子水(dH2O);

0.01M PBS-T(見(jiàn)表1);

塑料或玻璃管和瓶子;

塑料鉗;

組織學(xué)用品和設(shè)備:粘合劑,顯微鏡載玻片,蓋玻片,光學(xué)顯微鏡,震動(dòng)切片機(jī)或微切片機(jī),乙醇,二甲苯或二甲苯替代品,Permount®封片劑。

 

 

 

0.01 M PBS-T, pH 7.4

 

1000ml

NaCl

 

0.1 M PB (pH 7.4)

 

Triton X-100

 

加入 dH2O 至

 

加熱攪拌至50~55℃,以增強(qiáng) Triton X-100的溶解

8.5g

 

100ml

 

3ml

 

1000ml

表1:制備0.01M PBS-T,需先配制0.1M PB(左),然后配制含有0.3%Triton X-100的PBS(右)。

 

0.1M PB, PH7.4

 

1000ml

NaH2PO4 •dH2O

 

NaH2PO4 •7dH2O

 

加入 dH2O 至

 

(攪拌使其溶解)

2.62g

 

21.73g

 

1000ml

 

 

存儲(chǔ)、安全和處理注意事項(xiàng):

·•將試劑盒存放在室溫下。

·•試劑盒中的溶液A和C為含劇毒試劑。 需在通風(fēng)櫥中準(zhǔn)備并使用,使用完后收集所有廢物。

  套件A中含有用于危險(xiǎn)廢物處理的瓶子。

·•在處理試劑盒試劑時(shí),需戴上手套,眼睛和面部有適當(dāng)?shù)姆雷o(hù)以及穿戴合適的防護(hù)服,處理后需*清洗雙手。

·•處理時(shí)避免試劑的吸入和接觸皮膚,眼睛。 如接觸,立即用水*清洗,必要時(shí)尋求醫(yī)療援助。

 

 

建議

·•在處理溶液A和C時(shí)使用帶蓋的玻璃或塑料容器。

·•始終保持容器密閉。不要使用金屬工具來(lái)承裝溶液A。

·•使用溶液A,C或D處理大腦或切片時(shí),避免大腦或切片受光照影響。

·•不要重復(fù)使用或稀釋工作液,在室溫下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以獲得宜效果。

 

 

1.浸漬:將剛收獲的腦組織浸入溶液A中。溶液A的體積大約是組織塊體積的10倍。 例如, 20ml溶液A對(duì)應(yīng)成年大鼠腦(1cm×1cm×2cm)體積。

浸泡1~2天后更換溶液,并在室溫下繼續(xù)避光浸漬(建議浸漬天數(shù)見(jiàn)表2)。

意見(jiàn)建議:為了獲得宜侵染,建議用生理鹽水灌注動(dòng)物,清除組織中的血液。 麻醉動(dòng)物(例如用戊巴匕匕妥鈉,腹膜內(nèi)注射100mg / kg)。心臟內(nèi)或升主動(dòng)脈用0.9%生理鹽水(例如 1000ml dH2O中含有9g NaCl)灌注至內(nèi)臟血液量被沖洗掉。灌注通常需要3~5分鐘。 解剖大腦并將其謹(jǐn)慎地從頭骨上移除。用鋒利的刀片切割大腦至1厘米左右的厚度,在0.9%鹽水中短暫沖洗,然后浸入溶液A.

 

表2:20-22℃下建議的浸漬總天數(shù)(P:出生后一天; 如:P2表示“2天齡”)

動(dòng)物年齡

尺寸

浸漬時(shí)間

P2大鼠

全腦包括頭骨無(wú)灌注

無(wú)灌注,9天

P6大鼠

半球

鹽水灌注,7天

P*鼠

半球

鹽水灌注,9天

P24大鼠

半球

鹽水灌注,10天

P24大鼠

海馬塊包括皮質(zhì)

鹽水灌注,10天

3-4月大鼠

海馬塊包括皮質(zhì)

鹽水灌注,11天

P6小鼠

全腦

無(wú)灌注,8天   鹽水灌注,7天

2-3月小鼠

全腦

鹽水灌注,10天

5月小鼠

半球

無(wú)灌注,11-12天   鹽水灌注,11天

 

組織塊的類(lèi)型和大小的不同可能影響浸漬時(shí)間,理想的時(shí)間應(yīng)該通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究獲得。在大多數(shù)情況下較好的浸漬效果是在2周。如果浸漬超過(guò)2周,則可能出現(xiàn)非特異性染色

 

2.浸漬后:浸漬準(zhǔn)備好后,用蒸餾水或去離子水(dH2O)沖洗組織塊,然后將其轉(zhuǎn)移到套件B所制備的浸漬后緩沖液(30 g稀釋在90 ml dH2O)中,并在室溫下避光儲(chǔ)存。 浸泡一天后更新溶液,繼續(xù)浸泡一天。 在浸漬后2天后,將組織塊準(zhǔn)備好切片。

 

組織塊可以在4°C的緩沖液中儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)1個(gè)月

 

3.切片:可以使用振動(dòng)切片機(jī)或類(lèi)似類(lèi)型的切片機(jī)將大腦切割成厚度為100-200μm的切片。

切片應(yīng)收集在套件B制備的收集和安裝緩沖液(30g試劑B,在500ml dH2O中稀釋?zhuān)┲小?/span>

建議使用振動(dòng)切片機(jī)或微切片機(jī)進(jìn)行切片。如果切片機(jī)刻度范圍為1-10,則將速度和振幅設(shè)置為4級(jí)。 建議在分析樹(shù)枝狀分枝和樹(shù)突棘時(shí)使用100-200μm的厚度。 對(duì)于薄切片的切割(例如50μm),需將剃刀刀片浸入二甲苯中1-2分鐘來(lái)去除刀片上的油漬。

切片過(guò)程可在溫度設(shè)定在-16°C ~ -20°C的低溫恒溫器中進(jìn)行。

 

4.安裝:借助所提供的著色筆(大),將切片轉(zhuǎn)移到裝有收集和安裝緩沖液的填充盤(pán)(例如95×15mm培養(yǎng)皿)中。 使用圓頭筆(小),將切片安裝在粘性顯微鏡載玻片上。 1個(gè)載玻片上可安裝6~12個(gè)切片。

覆蓋切片:用吸水紙(例如濾紙)覆蓋濕的切片,然后通過(guò)輕壓載玻片來(lái)給吸水紙壓力,以增強(qiáng)切片與載玻片的粘附。

在室溫下風(fēng)干燥切片約1分鐘。 長(zhǎng)時(shí)間暴露在干燥空氣中會(huì)導(dǎo)致切片破碎。

將載玻片存放在干燥且封閉的染色罐中(已提供)。 放置在封閉的染色罐中的載玻片可以在室溫下儲(chǔ)存一天。一個(gè)染色罐可以存儲(chǔ)多達(dá)10個(gè)載玻片。

 

5.染色:用0.01M PBS-T洗滌載玻片20~30分鐘,然后用dH2O洗滌約1分鐘。 將載玻片置于用dH2O稀釋后的溶液C(體積比 3:5)中,在封閉的染色罐中保持20±2分鐘(將罐子儲(chǔ)存在黑暗區(qū)域中),然后將載玻片在dH2O中漂洗約1分鐘。

 

如“試劑盒提供的材料”中所述:溶液C必須在使用前用dH2O(體積比為3:5)稀釋。例如,將18ml溶液C與30ml dH2O混合,形成48ml工作溶液。試劑盒中提供染色罐可剛好裝下所制備的48ml工作液。48ml工作液可用于多達(dá)120個(gè)切片(例如,在所提供的染色罐中總共10個(gè)載玻片,每個(gè)載玻片黏附有12個(gè)鼠腦切片)。

 

為獲得宜效果,請(qǐng)勿重復(fù)使用稀釋的工作溶液。

為了防止切片滑落,切勿在dH2O中長(zhǎng)時(shí)間洗滌。理想的染色時(shí)間應(yīng)由實(shí)驗(yàn)研究獲得。通常較好的染色效果是在20分鐘左右。

 

6.復(fù)染色:將載玻片置于試劑D制備復(fù)染緩沖液中,在暗中放置20分鐘后在0.01M PBS-T中洗滌10分鐘×3次。

(可選染劑:在PBS-T洗滌后,切片可用甲酚紫、甲基綠或其他合適的染色試劑復(fù)染。)

用dH2O沖洗載玻片約1分鐘,然后風(fēng)干。當(dāng)切片不*干燥(通常需要5~10分鐘)時(shí),將載玻片存放在干燥且封閉的染色罐中,或繼續(xù)下一步操作“清潔和覆蓋”。

載玻片可以在室溫條件下儲(chǔ)存在罐中一天。

為了防止長(zhǎng)時(shí)間暴露在干燥空氣導(dǎo)致切片的碎片化,需將載玻片存放在干燥且封閉的染色罐中。

48ml復(fù)染緩沖液可用于多達(dá)120個(gè)切片(例如,如“5.染色”中所述,在染色罐中的12個(gè)切片×10個(gè)切片)。 為獲得宜效果,請(qǐng)勿重復(fù)使用工作溶液。

 

7.清潔和覆蓋:將載玻片在100%乙醇中脫水約10分鐘 ×4次。 在二甲苯或二甲苯替代物中清洗約10分鐘 ×3次。 蓋玻片采用的是Permount®封片劑。

superGolgi-染色用的切片儲(chǔ)存在室溫和黑暗區(qū)域。

上海起發(fā)實(shí)驗(yàn)試劑有限公司
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