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Douglas Gjerde于2002年在加利福尼亞州的圣何塞市建立了PhyNexus公司，以調查蛋白質樣品制備的需求。專欄和機器人被開發小型化和自動化過程，當保留蛋白質的自然狀態時。2005年，引進了一整列的專欄和機器人。在接下來的幾年中，柱子被修改為與所有主要的機器人液體處理器兼容。定期提供超過20種色譜柱的化學品，提供超過100種定制包裝的產品。從2016年開始，引入了試劑盒和儀器，大大增加了瞬時轉染質粒的可用性。PhyNexus客戶是制藥公司和學術界的生命科學家。

PhyNexus開發了一種*的微型工程蛋白質和抗體純化技術，使研究人員能夠定期純化和富集樣品量達1 mL。PhyTip™色譜柱的*設計允許低至10μL的洗脫體積，從而產生高達50倍的富集因子，純化蛋白濃度可達5 mg / ml。

純化和富集過程是一個簡單的三步技術，首先捕獲感興趣的蛋白質，然后純化并zui終富集。整個過程可能需要不到15分鐘，以產生高濃度的全功能蛋白質，以備進一步分析。

蛋白A PhyTip柱顯示功能性抗體（IgG）的高結合親和力和高容量親和力純化。

• 70-90％的IgG回收率
• 獲得高度濃縮的純化蛋白質
• 顯示蛋白A PhyTip柱可以從不同水平的背景蛋白中提取非常高純度的IgG蛋白

蛋白質A PhyTip列

具有蛋白A的PhyTip色譜柱已針對特定的PhyNexus試劑和儀器流速/體積進行了優化，如下所示。這些信息是使用PhyNexus純化系統收集的。所有含蛋白A的PhyTip色譜柱均配有推薦的PhyTip緩沖液，包括：捕獲緩沖液 - 適用于需要添加額外緩沖液以補充樣品體積并確保捕獲正確pH的情況。清洗緩沖液I - 磷酸鹽緩沖液pH 7.4清洗緩沖液II - 鹽水溶液。注意：無緩沖能力以確保有效洗脫富集緩沖液 - 用于zui終洗脫步驟 - 磷酸鹽緩沖液pH 2.5中和緩沖液。 - Tris緩沖液pH9.0注意：濃縮緩沖液以4mL的pH2.5磷酸鹽緩沖液提供，

含蛋白A樹脂的200多個PhyTip色譜柱：

對于含有1mg BSA的5μgIgG2a（抗FITC MAb。）的200μL樣品，使用下述條件進行處理，在zui終樣品體積中回收大于40％的原始IgG質量。另外，通過用考馬斯（Coomassie）檢測的SDS-PAGE測定，回收的IgG超過95％純。

捕獲：通過以250μL/分鐘的流速通過樹脂床4個循環捕獲200μL樣品。

純化：將200μL的PhyNexus蛋白A洗滌緩沖液I以500μL/ min的流速通過樹脂床兩個循環，接著用洗滌緩沖液II再次洗滌，在樹脂床上流過兩個循環速率500μL/ min。

富集：用10μLPhyNexus A蛋白富集緩沖液將蛋白質洗脫至溶液中，以500μL/ min的流速通過樹脂床5個循環。用3μLPhyNexus蛋白A中和緩沖液中和。

所運送的蛋白G富集緩沖液包含：111mM NaH 2 PO 4，14.8mM H 3 PO 4中的140mM NaCl，pH 3.0

含蛋白A樹脂的1000+ PhyTip色譜柱：

對于含有5mg BSA的10μgIgG2a（抗-FITC MAb。）的500μL樣品，使用下述條件進行處理，在zui終樣品體積中回收大于40％的原始IgG質量。另外，通過用考馬斯（Coomassie）檢測的SDS-PAGE測定，回收的IgG超過95％純。

捕獲：以250μL/分鐘的流速通過樹脂床捕獲500μL樣品四個循環。

純化：將1000μL的PhyNexus蛋白G洗滌緩沖液I以500μL/ min的流速通過樹脂床兩個循環，接著用洗滌緩沖液II再次洗滌，以流速500通過樹脂床兩個循環μL/分鐘。

富集：用15mL PhyNexus蛋白A富集緩沖液將蛋白洗脫到溶液中，以500μL/ min的流速通過樹脂床5個循環。用5μLPhyNexus蛋白A中和緩沖液中和。

蛋白APhyTip®色譜柱的性能特征和分析步驟

介紹

PhyNexusPhyTip®色譜柱是創新性的純化工具，從根本上簡化了各種來源的蛋白質的捕獲，純化和富集。這些凈化工具成功的關鍵是設計保留親和樹脂床的機制，具有zui小的死體積和zui大的捕獲潛能。一組PhyTipcolumn結合蛋白A在特定的*條件下特異性結合來自不同來源的抗體（IgG），因此可以去除核酸和其他污染物。快速洗滌步驟后，純化的抗體很容易用常用的低pH緩沖液洗脫。該技術允許特異性的高產量的IgG，取決于各種條件，并且提供在非常高濃度的載體蛋白如BSA存在下的高度選擇性純化。PhyTip色譜柱具有*的結合能力，可以結合大于100μg的IgG，并且可以有效地回收少至200 ng的IgG - 代表幾乎三個數量級的范圍。PhyTip色譜柱非常適合從雜交瘤上清液進行抗體篩選，或用于高通量提取和純化親和標記蛋白質。

績效和分析程序

IgG以高親和力和特異性結合蛋白A. 這種相互作用的強度和選擇性使蛋白質A能夠有效地從復雜的蛋白質混合物中純化出IgG。為了檢查用蛋白A樹脂的PhyTip柱的性能，測量了使用1000個蛋白A PhyTip柱的純化IgG（抗FITC-MAb）的回收百分比。

材料和方法

樣品：在0.5ml 
含有5mg BSA的PBS中的10μgmFITC-MAb（IgG2a亞類）或
2.含有10％FBS（胎牛血清）的DMEM或
3.含有5mg BSA的SFM（無血清培養基）
樣品處理：使用以下方案在半自動ME 1000平臺上處理所有樣品：

1. （1）捕獲：通過使樣品在樹脂床上以2個輸入/輸出循環（以0.6ml @ 0.25ml / min的體積設定）捕獲特定蛋白質。
2. （2）純化：通過用0.5mL PBS（洗滌緩沖液I）洗滌結合的蛋白質/親和樹脂，使用1進/出循環（體積設定為0.6ml，0.5ml / min）除去未結合的蛋白質，隨后是1進/出循環（體積程序為0.6ml，0.5ml / min）和0.5ml鹽水溶液（洗滌緩沖液II）。
3. （3）富集：用15μLpH 3.0洗脫緩沖液以4次輸入/輸出循環洗脫IgG2a（體積程序為0.1-0.15ml @ 1ml / min）。一旦洗脫，加入5μL中和緩沖液。請注意，PhyNexus提供的蛋白A和蛋白G PhyTip色譜柱的當前洗脫緩沖液的pH值為2.5，目前的中和緩沖液的pH值為9.0。

定量程序

（1）為了制備還原的IgG2a，將15μlzui終洗脫體積與5μl新鮮制備的TCEP（15μl10mg / ml TCEP的水溶液，終體積30μl）反應。

（2）使用HP 1050HPLC系統將20μl還原的IgG2a注射到無孔聚苯乙烯二乙烯基苯反相（C-18）柱中。溶劑A（0.1％TFA的水溶液）和溶劑B（0.1％TFA的ACN溶液）之間的梯度為25％至75％，使用5分鐘。檢測：在214和280nm處的UV。

3. （3）大約3.18和3.34分鐘時洗脫主要的IgG2a峰。在這兩個峰下面的區域在每種情況下從（3.13-3.5）分鐘積分，相應的峰面積在214nm處記錄。
4. （4）在相同的反應條件下將TCEP處理的IgG2a標準物加載到柱子中并用作回收計算的輸入或標準。

IgG2a恢復的結果

在DMEM + 10％FBS中的回收率=在SFM + 5mg BSA中的77％回收率= 64％。

已知載體蛋白如白蛋白誘導免疫應答并有助于產生良好的抗體，所以當抗體產生時其通常以高量存在。因此，任何純化和富集程序必須能夠耐受高濃度的白蛋白。另外，上面顯示的結果似乎表明高背景蛋白質濃度（例如BSA）的存在可能對回收率具有有益的影響。

載體蛋白存在下IgG2a回收率的重現性

為了驗證載體蛋白在zui大IgG2a回收率中的作用，并證實重現性，從多個樣品（n = 4）中從PBS（以及含有5mg BSA的PBS）純化IgG2a。結果表明在存在500倍過量的BSA濃度的情況下提高了純化的IgG2a的恢復（至少20％或更多），并且該程序也是高度可重現的。

在PBS中回收= 42.25％（SD = 4.66％）在PBS中回收+ 5mg BSA = 66.5％（SD = 7.5％）

選擇性性能和分析程序

為了表征和驗證蛋白A-IgG親和相互作用的選擇性，將5mg BSA作為載體蛋白加入到0.5ml樣品體積（333倍過量）中的15μgIgG中。使用蛋白A PhyTip柱處理樣品。

材料和方法

樣品：在含有5mg BSA（10mg / ml或1％w / v BSA）的0.5ml PBS或PBS中的15μgmFITC-MAb（IgG2a亞類）。樣品處理：如上所述的恢復性能和分析程序。

IgG定量和純度分析程序：

（1）將15μlzui終洗脫體積分成兩部分：13μl與新制備的13μl10mg / ml TCEP（終體積=26μl，[TCEP] = 17.5mM）在室溫下反應約16小時，同時在每個實驗中將2μl加載到凝膠上。

（2）使用HP 1050HPLC系統，將26μl以上的減少的IgG2a中的20μl注入到無孔聚苯乙烯二乙烯基苯反相（C-18）柱中。溶劑A（0.1％TFA的水溶液）和溶劑B（0.1％TFA的ACN溶液）之間的梯度為25％至75％，使用5分鐘。檢測：在214和280nm處的UV。

3. （3）在3.17和3.3分鐘左右洗脫兩個主要的IgG2a峰。這兩個峰下的面積在每種情況下從（3.13-3.5）分鐘積分，相應的mAU在214nm記錄。
4. （4）在相同的反應條件下，將TCEP處理的IgG2a標準物（注入量為1.08,2.16,4.32,6.48和8.64μg的FI TC-M Ab）加載到柱中并用作恢復計算的標準曲線。

PhyNexus建議使用含有IgG的PhyTip入門試劑盒作為標準來驗證PhyTip色譜柱在所有應用中的使用。

純化和富集的樣品必須清晰，無顆粒物質。強烈建議離心樣品，并使用PhyTip色譜柱前僅使用清澈的上清液。

運輸和存儲

每包PhyTip色譜柱已經制造并按照zui高標準進行了質量控制，并運送到保持盒中，以保持每個PhyTip色譜柱內特定親和樹脂的完整性。本產品在環境溫度下運輸，但收到時應存放在標準的實驗室冰箱中，溫度在4℃到8℃之間。

• 不要凍結或凍結。
• 不使用時，請將箱子的蓋子關好并密封好，存放在冰箱內。
• 不要讓親和樹脂在干燥的環境中長時間存放干燥。

當從PhyNexus運輸時，含有蛋白A的PhyTip色譜柱儲存在甘油中。

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